ELISA檢測流程詳解

ELISA（酶聯免疫吸附測定）是一種常用於生物醫學研究中的實驗方法，廣泛應用於抗體、抗原、激素、病毒等的檢測。通過ELISA檢測，科研人員可以獲得定量或定性的分析結果，這使得它在臨床診斷、疾病監測以及藥物研發中有著不可替代的作用。

ELISA檢測

一、包被階段ELISA檢測的首要步驟是將待測的首要成分固定於包被板上。這一過程主要通過被動吸附實現，其效果取決於包被物質的性質。若樣品中含多種抗原，則需選用具有選擇性的包被板，以避免非特異性結合。然而，在間接ELISA法檢測抗體時，使用純化抗原；或在夾心ELISA法中，使用捕獲抗體時，包被板已具備選擇性。包被板材質多為聚苯乙烯或其衍生物，其結合特性因目標物質及檢測需求而異。對於某些難以吸附的物質，如高度糖基化的蛋白質、碳水化合物等，建議使用允許共價連接的特殊處理包被板。

二、孵育階段試劑加入包被板後，需進行孵育，以促進結合或反應。孵育的溫度和時間依據檢測步驟及操作而異。通常，樣品應用後於37℃孵育1小時。然而，某些步驟，如阻斷，可在冰箱中過夜進行；而測定過程中的孵育則通常在室溫下短時間進行。

三、洗滌階段洗滌是ELISA檢測中至關重要的步驟，需在每次應用檢測成分後進行，直至結果測定。洗滌時，通常使用磷酸鹽緩衝鹽水-20（PBST）作為緩衝液，以去除未結合的抗原、抗體或試劑。洗滌可手工使用多通道移液器完成，也可使用自動洗板機。洗滌不充分可能導致高背景信號，而過度洗滌則可能導致樣品信號降低。洗滌的一致性對於確保板塊結果的可靠性至關重要。

四、阻斷階段在蛋白質包被ELISA板後，通常需進行阻斷，以防止後續步驟中抗體的非特異性結合。阻斷時，向板中加入與檢測無關的混合蛋白並進行孵育，以佔據非特異性結合位點。常用的阻斷緩衝液包括脫脂幹乳、牛血清白蛋白（BSA）和酪蛋白。此外，非離子洗滌劑如Tween 20或Triton X-100也可作為阻斷劑使用，但其阻斷效果不如蛋白質持久。無效的阻斷會導致背景噪音增加，降低檢測的靈敏度和特異性。

五、抗體階段抗體是ELISA檢測的關鍵組成部分，選擇合適的抗體至關重要。單克隆抗體和多克隆抗體均可使用，各有優缺點。單克隆抗體具有高特異性，但成本較高；而多克隆抗體則能在多個結合點與目標物質結合，從而放大信號並提高靈敏度。使用二級抗體雖增加了步驟和檢測時間，但可能帶來靈敏度的提高。因此，在優化檢測時，需找到合適的抗體對。

六、測定階段無論採用何種類型的ELISA檢測，最後一步均為測定。最常用的測定方法是利用酶介導的可見顏色變化化學反應，隨後通過紫外-可見分光光度法進行測量。酶結合抗原或抗體被添加到測試孔中，若目標物質存在，則與其結合。當加入適當底物時，酶會引發顏色變化，其程度與目標物質的數量成正比。辣根過氧化物酶（HRP）是常用的共軛物之一，通常與底物3,3',5,5'-四甲基聯苯胺（TMB）配合使用。在HRP的作用下，TMB由藍色變為黃色，隨後加入硫酸溶液終止反應。最後，使用酶標儀在450nm波段測定每個孔的吸光度值，並根據檢測設計進行校正和計算，如減去空白孔平均值、技術重複平均值或與標準比率計算。

ELISA檢測是一個複雜但非常重要的實驗方法，廣泛應用於各類醫學研究和診斷。通過對ELISA檢測流程的理解和掌握，科研人員可以準確、快速地獲取相關數據，為疾病的早期診斷、藥物的研發等提供科學依據。

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