在OT-2上使用Biotage雙流層析PhyTip管柱進行自動化蛋白質純化

作者：

BO人    Lin,PhD,SHA碟     NI MRI?Sean    Arabian?kin那日     Watson,PhD i 1open TR ONS  lab works 

摘要本次應用針對使用 BiotagePhyTip° 管柱在 Opentrons OT-2 自動 化移液工作站上進行雙流層析的自動化進行了應用開發。測試了兩 種類型的 PhyTip 管柱：用於 His 標記蛋白萃取的 Ni-IMAC 管柱和用於 人源 IgG 純化的蛋白 A 系列管柱，包括蛋白 A、ProPlus 和ProPlus LX。結果表明，OT-2 和 PhyTip 柱結合使用96孔板進行小規模蛋白樣品處理，可獲得優異的樣品產量、濃度。

關鍵發現在使用PhyTip Ni-IMAC柱進行純化時， OT-2 能夠在保持活性 的同時對His標記的GAPDH 蛋白進行純化。同時，使用蛋白 A、ProPlus 和 ProPlus LX PhyTip 管柱進行人類 IgG 純化時，OT-2 也展現了出色的純化能力。使用蛋白A、ProPlus 和ProPlus LX PhyTip 管柱，可在OT-2上全自動執行多步驟純化，例如免疫沉澱。 ● 蛋白質分析驗證了萃取蛋白為目標蛋白，成品是符合預期的。 ● 在實驗設定中，此應用協議可處理最多96個樣品，且僅需佔用很少的人工操作時間。

簡介近年來，由於蛋白質表徵分析和功能測定的發展迅速，業界對蛋白 質分析的需求與日俱增。因此，許多可用於透過親和層析擴大蛋白 質分離通量的技術應運而生，而親和層析已成為早期藥物發現中的重要工具。然而，市面上適用於小規模蛋白純化的設備卻很少。並且由於研究人員缺乏程式設計和自動化專業知識，可能會導致在建立 這些流程時產生許多不必要的開銷，在優化工作流程時，會帶來額外的成本負擔。

PhyTip 柱是基於移液器吸頭進行工作的色譜柱，透過移動相(例如樣品溶液)在固定相(即填充在尖端中的樹脂)上的雙向流動來將目標生物分子與非目標分子分離，這個過程被稱為雙流層析。純 化後的樣品可以以小體積洗脫，得到高濃度的樣品。雙流層析 是一種溫和的純化過程，產生具有高生物活性的蛋白質。這些 PhyTip 柱利用了蛋白 A 進行抗體的純化或富集。蛋白 A 是一種分 子量為49 kDa 的蛋白，對大多數 IgG 的 Fc 區域有較高的親和力。

ProPlus (MabSelectTM SuReTm,Cytiva)和ProPlus LX (MabSelect SuRe,Cytiva) 是使用經過改良的蛋白 A 來製備吸頭。蛋白 A 具有更強的結合目標 IgG 的能力，通常被用於抗體的純化和富集。

金屬親和層析(IMAC) 是另一種常見的方法，用於從粗樣品中純 化或富集目標蛋白。這種方法利用金屬離子提取具有基因工程標籤 的重組蛋白，它們通常是能夠螯合金屬離子的勝肽序列。 PhyTip柱與 鎳離子(Ni)-IMAC 親和力樹脂結合，透過 Ni2+ 和組胺酸鹼基之間的強親和力，高效純化多組胺酸 (His) 標記的蛋白。

OT-2 是一個對生物學家非常友善的自動化平台。 PhyTip 柱使用與 OT-2 的單通道和8通道移液管相容的吸頭，從而實現了在 OT-2 上 執行全自動蛋白純化。本研究對 PhyTip 管柱在 OT-2 上的性能表現進行評估，並展示了該平台可適應多種應用的能力。透過PhyTip 管柱與 OT-2 平台結合使用，研究人員能夠實現自動化運 行蛋白質純化，提高操作的便利性和一致性。這為各種不同的應用提供了更適用的解決方案，並為高通量的純化和富集提供了支持。

材料和方法在Opentrons OT-2 平台上使用PhyTip 色譜柱進行蛋白質純化工作流程概述該過程的第一部分是“試劑孔板準備”,用於準備PhyTip 柱架和試劑孔板。其中包括平衡緩衝液孔板、兩個用於不同洗滌緩衝液的孔 板以及一個洗脫緩衝液孔板。過程的第二部分是「蛋白質純 化」,透過使用 PhyTip 柱進行雙流層析來捕獲和富集目標蛋白 質。這是透過使樣品或緩衝液通過柱體內部的樹脂(即上下移液) 而實現的。設定環節包括循環次數、流速和緩衝液體積，這些設定根據特定應用進行調整(表1)。

表1: PhyTip 管柱在 Opentrons OT-2 上測試的設定和運行時間

試劑孔板製備和蛋白質純化方案的OT-2 平台佈局示意圖(圖1)在本研究中測試的PhyTip 柱型號包括：● Pro A 20μL PTX-93-20-01● ProPlus 20 μL PTX-93-20-07● ProPlus LX 20 μL PTX-93-20-26● Ni-IMAC 20 μL PTX-93-20-03

蛋白質純化流程1.取出 PhyTip 管柱2.平衡化3.捕獲目標蛋白質4.洗滌(第一次)5.洗滌(第二次)6.洗脫

實驗結果分離His 標記的GAPDH, 同時保留活性通過SDS-PAGE 和蛋白定量分析，我們得出了在PBS 中提取的帶有His 標籤的GAPDH 樣品具有理想產量和一致性的結論(平均產量為79%,變異係數為3%) (圖2上部)。

從細菌裂解液中分離His 標記的GAPDH生產重組蛋白的常見方法是用質粒轉化大腸桿菌OT-2 平台上使用PhyTip 柱沒有破壞酶活性，這是透過GAPDH活性測定得出的結果(圖2中部) 。此外，結果還表明，在兩種不同蛋白質的樣品中均能夠成功地將 His 標記的 GAPDH 與非目標蛋白的BSA 分離開來(圖2下部)。

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