文庫定量的常見方法與技巧

在探索高通量測序（NGS）的廣闊領域中，文庫定量作為確保測序數據質量與深度的關鍵環節，扮演著至關重要的角色。這一步驟不僅關乎實驗的成功與否，還直接影響到後續生物信息學分析的準確性和可靠性。隨著技術的不斷進步，文庫定量的方法日益多樣化，每種方法都各具特色，適用於不同的實驗場景和需求。

文庫定量

一、文庫定量的重要性1、確保測序數據質量：文庫定量可以確保測序儀上載入的DNA文庫量適中，從而避免文庫濃度過高導致的低質量測序數據或文庫濃度過低導致的測序數據產量不足。 2、穩定產出各樣本數據量：在多個文庫合併測序時，文庫定量有助於根據測序數據量的要求混合相應摩爾量的文庫，以穩定產出各樣本數據量。

二、常見方法1、紫外分光光度法（1）原理：核酸（包括DNA和RNA）中的鹼基含有芳香環結構，因此具有紫外吸收的特性。核酸的紫外吸收峰在260nm處，與此同時，還能通過計算A260/A280和A260/A230的數值，估計核酸的純度（280nm吸光通常來自蛋白質，而230nm則通常來自醣類和苯酚等）。 （2）缺點：無法區分DNA和RNA，因為具有紫外吸收的結構是核酸的鹼基，而DNA和RNA均含有鹼基，因此當一份樣品同時含有DNA和RNA的時候，測定濃度會高於其真實濃度。 2、熒光染料法（1）原理：使用靶標特異性染料，該染料可以特異地與不同種類的核酸鏈相結合，並在特定波長光源的激發下發出熒光。其中，結合了核酸的熒光染料相比那些游離的，信號可增幅數十倍至數百倍，因此可以和背景區分開來。 （2）操作：將待測DNA樣品與熒光染料混合，熒光染料會與DNA結合，形成熒光復合物。然後將混合物放入Qubit測量儀器中，儀器會通過激光激發熒光復合物，使其發出熒光信號。 Qubit測量儀器會根據熒光信號的強度自動計算出DNA的濃度。 （3）優點：靈敏度高，操作簡便快速，檢測流程高效，可以輕鬆地分析數十個樣本，內置的分析軟件簡化了數據計算，在檢測結束後立即呈現文庫濃度。 （4）缺點：當樣本增加到20~30個以上時，此種檢測方法不太適用；檢測的準確度略低，結果一般不作為終濃度用於上機。 3、實時熒光定量PCR法（qPCR）（1）原理：利用熒光檢測技術與PCR技術相結合，在PCR反應體系中加入熒光基團，通過實時監測整個PCR過程中熒光信號的變化情況，反映濃度的變化，最後通過已知濃度的標準曲線計算未知樣品的濃度，以達到準確定量文庫濃度。 （2）優點：特異引物僅會定量兩端接頭連接完整的文庫，可排除單端或雙端都不連接接頭的不可測序文庫的干擾，準確度高，是目前業內進行文庫定量推薦的方法，適用於測量珍貴樣本以及文庫上機pooling前的精准定量。 （3）缺點：成本較高。

三、技巧1、消除和避免核酸污染：文庫定量使用的Standards濃度從高到低，高濃度Standards容易對環境造成核酸污染，從而影響陰性對照和低濃度Standards的結果。因此，做文庫定量的實驗室需要定期除核酸。可以在實驗技術後，用紫外處理，將環境中的核酸氧化。 2、文庫稀釋驗證：文庫建議稀釋2個梯度，相互驗證。說明書上建議是10000倍和20000倍，在具體實驗操作時設置2個梯度濃度相差10倍也可以。要注意的是10000倍和20000倍得出的Ct值的差應該為1附近，可以在0.951.05之間，10000倍和100000倍得出的Ct值差在3.34附近，可以在3.23.5之間，如果超出這兩個區間，則2個梯度的誤差會比較大，這種誤差有可能是稀釋不准引起。 3、排除擴增效率影響：當計算的結果出來，發現文庫稀釋成2個梯度所獲得的濃度偏差較大時，可能是由於稀釋不准，或者該文庫的擴增效率較低，導致△Ct偏大。此時，可以將這個文庫做4~5個10倍稀釋梯度，上機，根據上機的Ct值計算擴增效率，從而排除擴增效率的因素。

文庫定量作為高通量測序流程中的關鍵環節，其重要性不言而喻。通過合理選擇定量方法和靈活應用定量技巧，科研人員能夠更加精準地掌握文庫的質量信息，為後續的生物信息學分析和科學研究奠定堅實的基礎。

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